消化组织样本–个细胞过夜。酶热灭活后将μ混合物用作的模板。突变检测使用三种不同的方法检测基因的突变。和荧光熔解曲线分析。利用迄今为止在甲状腺癌中发现的所有突变仅限于核苷酸的事实我们开发了一种新的方法在仪器罗氏分子生化公司曼海姆德国上使用实时和进行检测。
设计了突变位点侧翼的一对寡核苷酸
引物和以及两个荧光探针传感器和锚传感器探针跨越核苷酸位置。所有希腊企业电子邮件列表引物和探针均购自德国柏林。在玻璃毛细管中进行扩增使用μ体积中的其中包含μ×杂交探针包含缓冲液脱氧核苷酸三磷酸盐和聚合酶μ每种引物以及每种杂交探针。对反应混合物进行个循环的快速包括℃变性秒℃退火秒和℃延伸秒。通过以秒的速率将样品从逐渐加热到来进行后扩增。通过绘制与温度相对应的荧光信号的负导数−来构建荧光熔解峰。
正常胎盘用作阴性对照来自具有已知核苷酸突变
的肿瘤样本的用作阳性对照。所有与野生型胎盘熔解峰存比利时电话号码列表在偏差的产物在通过试剂盒纯化后进行测序以验证突变的存在。单链构象多态性。如前所述通过筛选样本中基因外显子和内的突变。对于外显子突变我们使用来自黑色素瘤细胞系和甲状腺细胞的对于外显子突变我们使用来自小细胞癌细胞系的作为阳性对照。直接从干燥的凝胶上切下异常的条带并进行测序。直接测序。通过外显子和
